丹皮酚和山奈酚抑制巨噬细胞泡沫化机制的比较研究

【摘要】目的动脉粥样硬化是危害人类健康的主要疾病之一，常常累及心、脑、肾等重要器官，是冠心病、心肌梗死、脑卒中等缺血性心脑血管疾病的主要病理学基础。国外有山奈酚抗动脉粥样硬化的相关报道，如山奈酚可通过抑制巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），减少巨噬细胞的泡沫化；山奈酚亦可通过调节OPN–CD44通路改善脂蛋白敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。由此可知，山奈酚抗动脉粥样硬化的作用比较明确。本实验室研究表明，给予山萘酚（30mg/kg，150mg/kg）10周可显著改善高脂诱导动脉粥样家兔的病理进展。山奈酚是通过提高家兔抗氧化能力，减少炎症介质如TNF-α和IL-1β的表达，增加血管粘附分子如E-sel、ICAM-1和VCAM-1的分泌，从而减少炎症细胞的粘附、迁移和聚集，抑制炎症反应的始动和进程，最终起到抗动脉粥样硬化的作用。丹皮酚是从丹皮中提取的抗氧化物，其对心血管疾病有保护作用。丹皮酚也能延缓家兔动脉粥样斑块的进展，但目前国外鲜见关于丹皮酚对动脉粥样硬化影响的报道。虽然丹皮酚和山奈酚均有抗动脉粥样硬化的作用，但关于山奈酚抗动脉粥样硬化作用的报道较多，作用机制也比较详实，且丹皮酚抗动脉粥样硬化的相关报道相对较少。因此，我们将丹皮酚与抗动脉粥样硬化作用较明确的山奈酚的作用机制进行比较，一方面，为丹皮酚抗动脉粥样硬化的作用机1理与山奈酚的异同提供更有力的依据；另一方面，进一步补充了山奈酚抗动脉粥样硬化的机制。文献认为，动脉粥样硬化损伤部位泡沫细胞的聚集是早期动脉粥样硬化的标志，因此我们比较了丹皮酚和山奈酚抑制巨噬细胞泡沫化机制的异同。方法采用MTT法选择对巨噬细胞无细胞毒性的丹皮酚和山奈酚浓度；油红O染色观察丹皮酚和山奈酚对ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响以及丹皮酚能否减少ApoE-/-小鼠动脉斑块的形成；RT-PCR检测丹皮酚和山奈酚对巨噬细胞膜蛋白ABCA1、ABCG1、SR-BI、SR-A、CD36mRNA表达的影响；Westernblot检测丹皮酚和山奈酚对巨噬细胞膜蛋白ABCA1、ABCG1、SR-BI、SR-A、CD36蛋白水平的影响；观察HO-1shRNA转染巨噬细胞干扰HO-1RNA后，能否逆转丹皮酚和山奈酚对巨噬细胞泡沫化的影响。结果(一)山奈酚通过减少巨噬细胞内脂质的聚集，促进巨噬细胞胆固醇的排出，从而抑制巨噬细胞的泡沫化。此外，山奈酚下调了巨噬细胞CD36蛋白的表达，上调了ABCA1、ABCG1、SR-BI蛋白的表达，但是山奈酚对巨噬细胞SR-A蛋白的表达无影响。山奈酚对巨噬细胞ABCA1、ABCG1、SR-BI、CD36、SR-AmRNA表达的影响与蛋白表达的影响一致。由于采用AP-1的抑制剂SP600125处理细胞后，增强了山奈酚抑制巨噬细胞CD36表达的作用。因此，山奈酚抑制巨噬细胞CD36表达可能与减少c-Jun-AP-1的核转位有关。此外，SP600125增强了山奈酚抑制巨噬细胞内脂质聚集的作用。采用HO-1shRNA干扰巨噬细胞HO-1表达后，减少了山奈酚增加巨噬细胞ABCA1、SR-BI、ABCG1表达的作用，表明山奈酚上调ABCA1、SR-BI、ABCG1的表达可能与HO-1有关。此外，HO-1shRNA可逆转山奈酚减少巨噬细胞内脂质聚集及促进巨噬细胞胆固醇排出的作用。总之，山奈酚依赖于c-Jun-AP-1下调CD36的作用，依赖于HO-1上调ABCA1、ABCG1、SR-BI的作用，可能是山奈酚对巨噬细胞泡沫化有保护作用的原因。(二)丹皮酚减少巨噬细胞内脂质的聚集，可能与丹皮酚减少巨噬细胞对ox-LDL的摄取及增加巨噬细胞胆固醇的排出能力有关。丹皮酚降低了巨噬细胞CD36表达，但不影响巨噬细胞SR-A的表达。此外，丹皮酚通过减少c-Jun的核转位减少巨噬细胞CD36蛋白及mRNA的表达。丹皮酚能增加巨噬细胞ABCA1蛋白的表达，但不影响ABCA1mRNA的表达。巨噬细胞ABCG1、SR-BI蛋白及mRNA表达均未受到丹皮酚的影响。丹皮酚通过减少Calpain活性增加ABCA1蛋白稳定性，从而增加了ABCA1蛋白的表达。此外，HO-1shRNA逆转了丹皮酚对c-Jun核转位、CD36、ABCA1、calpain活性，细胞内脂质的聚集的保护作用。体内研究显示，丹皮酚可降低ApoE-/-小鼠的血脂水平，延缓小鼠动脉粥样斑块的进展。此外，丹皮酚对ApoE-/-小鼠胸主动脉SR-A、CD36、ABCA1、ABCG1、SR-BI蛋白表达的影响与体外研究结果一致。总之，丹皮酚通过HO-1下调巨噬细胞CD36的表达，上调ABCA1蛋白的表达可能是丹皮酚促进巨噬细胞胆固醇的排出以及抑制细胞内脂质聚集的原因。(三)由上述丹皮酚和山奈酚的研究结果可知：（1）丹皮酚和山奈酚均通过减少巨噬细胞对ox-LDL的摄取，增加巨噬细胞排出胆固醇量，从而减少巨噬细胞内脂质的聚集。（2）丹皮酚和山奈酚均通过抑制c-Jun的核转位从而减少巨噬细胞膜蛋白CD36mRNA及蛋白水平的表达。（3）丹皮酚通过减少calpain的活性，上调巨噬细胞ABCA1的蛋白稳定性，但是丹皮酚对ABCA1mRNA、ABCG1和SR-BI蛋白及mRNA的表达均没有影响；对于山奈酚，其可上调ABCA1、ABCG1、SR-BI蛋白及mRNA水平的表达，且该上调作用与山奈酚增加HO-1的表达有关（。4）用HO-1shRNA干扰HO-1表达后，逆转了丹皮酚对巨噬细胞c-Jun核转位，CD36及ABCA1的表达，calpain的活性，以及巨噬细胞内脂质累积的保护作用；HO-1shRNA干扰HO-1后，抑制了山奈酚减少巨噬细胞内脂质聚集及促进巨噬细胞排出胆固醇的作用以及山奈酚增加ABCA1、ABCG1、SR-BI表达的作用。（5）此外，丹皮酚可以延缓ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生发展，且丹皮酚对ApoE-/-小鼠胸主动脉内CD36和ABCA1蛋白表达的调控与体外研究结果一致；由于已经有研究表明山奈酚可延缓ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生发展，且我们的研究显示，山奈酚有减少家兔动脉粥样斑块进展的作用，故在此未作相关研究。结论尽管山奈酚与丹皮酚均能抑制巨噬细胞的泡沫化，但是具体的抑制机制是有异同的。山奈酚抑制巨噬细胞泡沫化作用与通过c-Jun-AP-1上调CD36表达，通过HO-1上调ABCG1,SR-BI,ABCA1表达有关；丹皮酚对巨噬细胞泡沫化的保护作用与丹皮酚通过HO-1上调ABCA1蛋白稳定性以及通过HO-1-c-Jun-AP-1抑制CD36的表达有关。山奈酚与丹皮酚作用机制的不同，可能与两者化学结构的差异有关。通过将丹皮酚与抗动脉粥样硬化作用较明确的山奈酚比较抑制巨噬细胞泡沫化机制的异同，不但为丹皮酚抗动脉粥样硬化的作用机理与山奈酚的异同提供更有力的依据，同时丰富了山奈酚抗动脉粥样硬化的作用机理，为防治动脉硬化的新候选药物发现提供可借鉴的思路。
【作者】李秀英；
【导师】周远大；
【作者基本信息】重庆医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】丹皮酚；山奈酚；动脉粥样硬化；巨噬细胞；血红素加氧酶-1；

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